بررسي اثرات محافظت كبدي گياه بيلهر بر سميت القاء شده توسطتتراكلري� �كربن در موش صحرايي
دکتر هيبت اله صادقي*1، ايزدپناه قيطاسي**، نوراله مزروقي***، سهيلا سبزعلي****استادیار گروه بیوشیمی – دانشگاه علوم پزشکی یاسوج،**مربی گروه فیزیولوژی – دانشگاه علوم پزشکی یاسوج، ***پزشک عمومی – دانشگاه علوم پزشکی یاسوج.چکیده:
زمينه و هدف:امروزه بیماری های کبدی یکی از مشکلات مهم جوامع بشری است. یافتن دارویی مؤثر در درمان این اختلالات مورد توجه محققین و پزشکان می باشد. بیلهر (Dorema auchri) از گیاهان تیره چتریان است و ساکنان مناطق جنوبی کشور از این گیاه استفاده غذایی می نمایند و بر این باورند که خواص دارویی مفیدی نیز دارد. لذا اين مطالعه با هدف بررسی اثرات محافظت كبدي عصاره گياه بيلهر بر مسموميت القايي ناشي از مصرف تتراكلريدكرب� � (CCl4) در موشهاي صحرايي انجام شد.
روش بررسی:در یک مطالعه تجربی 30 سر موش صحرایی نر آلبینو از نژاد ویستار به پنج گروه شش تایی تقسیم شدند. یک گروه به عنوان کنترل و در چهار گروه دیگر توسط تتراکلرید کربن سميت كبدي (هپاتوتوکسیک) ايجاد شد. از این چهار گروه یک گروه به عنوان شاهد و در سه گروه دیگر روزانه به ترتیب 200، 400 و 500 میلی گرم از عصاره پودر گیاه به صورت دهانی داده شد. 45 روز بعد از شروع مطالعه در کلیه گروهها آنزيمهاي آلانين آمينوترانسفر� �ز (ALT)، آسپارتات آمينوترانسفر� �ز (AST) و آلكالين فسفاتاز (ALP) و همچنين غلظت هاي سرمي پروتئين تام، آلبومين و بيلي روبين که از شاخص های آسیب های کبدی است
اندازه گیری و با استفاده از آزمون آماری ANOVA تجزیه و تحلیل گردید.
یافته ها:تزريق درون صفاتي تتراکلرید کربن باعث افزايش فعاليت AST، ALT، ALP به ترتيب به ميزان85/117، 6/468 و 97/134 درصد و كاهش غلظت پروتئين تام و آلبومين و افزايش غلظت بيلي روبين به ترتيب به ميزان 8/16، 3/20 و 880 درصد در مقايسه با گروه كنترل شد (001/0p<). مصرف عصاره گياه بيلهر سبب گرديد اين فاكتورها به طور معني داري (05/0p<) به وضعيت نرمال نزديك شوند.
نتیجه گیری: نتايج حاصل از اين مطالعه نشان مي دهد عصاره گياه بيلهر در برابر آسيب هاي كبدي ايجاد شده توسط تتراكلريدكرب� � داراي اثرات محافظتي است.
واژه های کلیدی: آلانین آمینوترانسفر� �ز، آسپارتات آمینوترانسفر� �ز، آلکالین فسفاتاز،بيله� �، تتراكلريدكرب� �، كبد.
مقدمه:
بيماريهاي كبدي يكي از مشكلات جدي و تهديد كننده سلامت جامعه بشري مي باشند. امروزه مشخص شده است كه استئاتوزيس و فيبروزيس زمينه ساز بروز سيروز كبدي كشنده در انسان است. اگر چه پاتوژنز فيبروزيس
كبدي كاملاً مشخص نشده است اما بدون شك نمونه هاي واكنشگر اكسيژن (Reactive Oxygen Species=ROS) نقش مهمي در تغييرات پاتولوژي كبد دارند(1). غشاهاي بيولوژيكي از حســاس ترين بخشهاي سلـولي نسبت بــه
اثرات ROS مي باشند. پراكسيداسيون اسيدهاي چرب اشباع نشده در غشاء هاي بيولوژيكي علاوه بر كاهش سياليت باعث تخريب آنها مي شود(2).گرچه مكانيسم هاي محافظتي درون سلولي به ميزان زيادي آسيب هاي ناشي از ROS را كاهش مي دهند اما به علت فراواني توليد اين راديكالهاي آزاد وجود راههاي محافظتي ديگري بويژه آنتي اكسيدانهاي مواد غذايي براي سلامتي انسان بسيار مهم مي باشد. وجود تركيبات طبيعي بويژه نمونه هاي گياهي كه خاصيت آنتي اكسيدان دارند داراي اين ويژگي هاست (3). تعدادي از گياهان موجود در طب سنتي كشورهاي مختلف به علت داشتن آنتي اكسيدانها خاصيت محافظت كبدي دارند.
از جمله گياهاني كه در سالهاي اخير از نظر خاصيت محافظت كبدي مورد مطالعه قرار گرفته اند
Roobos tea (3) Tephorosia purpurea(4) Trichilia emetica(5)Foeniculum vulgar (6) می باشند.در طب سنتي ايران گياهان زيادي وجود دارد كه در
نـاراحتي هاي كبدي مصرف آنها سفارش شده اند. برخي از اين گياهان مانند كاسني، خرفه (7) و بيلهر (8) خوراكي هستند.
گياه بيلهر از خانواده چتريان است كه در اوايل فصل بهار در برخي از استانها از جمله كردستان، لرستان، چهارمحال بختياري، فارس و كهگیلويه و بويراحمد رويش دارد. به عنوان چاشني در رژيم غذايي ساكنان مناطق مذكور از ساقه و برگ های تازه آن استفاده
مي شود. بيلهر گياهي است سرشار از فلاونوئيد و اولين گياه از خانواده چتريان است كه اين مواد را تراوش
مي كند (8). مصرف گياه بيلهر تري گليسريد و كلسترول خون را پايين مي آورد (9) اما در مورد ديگر خواص بيولوژيكي آن هيچگونه مطالعاتي صورت نگرفته است. با توجه به وجود انواع فلاونوئيد در اين گياه و اينكه برخي فلاونوئيدها خاصيت آنتي اكسيدان دارند و همچنين نقش
آنتي اكسيدانها در محافظت از كبد در اين مطالعه خاصيت محافظت كبدي اين گياه در مسمومیت القایی ناشی از مصرف تتراکلرید در موش صحرایی مورد ارزيابي قرار گرفت.
روش بررسی:
بخش هاي هوايي گياه بيلهر که مصرف خوراکی دارد در اوايل فصل بهار در سال 1384 از كوههاي اطراف شهر ياسوج مركز استان كهگیلويه و بويراحمد جمع آوري و در شرايط مناسب، دور از نور آفتاب خشك و سپس پودر شد. 500 گرم از پودر گياه بيلهر در مخلوط آب و اتانول به نسبت 1 به 1 به مدت 24 ساعت خيسانده و سپس صاف گرديد. اين عمل طي دو مرحله انجام مي گرفت. تحت شرايط خلاء و دماي 50 درجه سانتيگراد عصاره تغليظ در انكوباتور با دماي 50 درجه سانتي گراد خشك و با آب مقطر دوبار تقطير به حجم نهايي ml500 رسانده شد. عصاره بدست آمده درويالهاي 10 ميلي ليتري تا زمان استفاده در فريزر20- درجه سانتی گراد نگهداري گردید (5).
30 سر موش هاي صحرايي آلبينو نر از نژاد ويستار و با وزن 180 تا 200 گرم از حيوانخانه دانشگاه علوم پزشكي اهواز خريداري و به حيوانخانه دانشكده پزشكي ياسوج منتقل گرديد. حيوانات به صورت چرخه 12 ساعت تاریكي و 12 ساعت روشنايي با دماي 25 درجه سانتي گراد نگهداری که از نظر رژیم غذایی و آب محدودیتی نداشتند. بعد از يك هفته سازگاري حيوانات با شرايط جديد موشها به طور تصادفي به پنج گروه شش تايي تقسيم شدند. گروه اول (گروه كنترل) كه روغن زيتون با دوز يك ميلي ليتر به ازاء هر كيلوگرم وزن حيوان به صورت درون صفاقي دريافت كردند. گروه شاهد (گروه دوم) و گروههای آزمون يك ميلي ليتر محلول تتراكلريدكرب� � و روغن زيتون (به نسبت 1:1) به ازاء هر كيلوگرم وزن حيوان به صورت درون صفاقي هفته اي دوبار دريافت كردند.
گروههاي سوم، چهارم و پنجم (گروههاي آزمون) پس از تزريق محلول تتراكلريدكرب� � و روغن زيتون روزانه به
ترتيب 200، 400 و 500 ميلي گرم به ازاء هر کیلوگرم وزن حیوان از عصاره پودر به صورت دهاني دريافت مي كردند. در تمام گروهها به صورت هفتگي وزن موشها اندازه گيري شد. 45 روز بعد از شروع مطالعه موشها با دي اتيل اتر بيهوش و از قلب آنها خونگيري شد و پس از بیهوشی نخاعی در موشها كبد آنها به صورت كامل از بدن جدا و بعد از اندازه گيري وزن آنها براي مطالعات هيستولوژيك در فرمالين 10 درصد نگهداري گرديد (3). نمونه خون هاي بدست آمده 20 دقيقه در شرايط آزمايشگاه نگهداري و بعد از ***ه گيري به مدت 15 دقيقه با 2000 دور در دقيقه سانتريفوژ شدند. سپس سرم هر لوله جمع آوري و ترانس آمينازهاي خون (AST و ALP)، آلكالين فسفاتاز، بيلي روبين تام، پروتئين تام و آلبومين اندازه گيري شد (5،10).
اطلاعات بدست آمده با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA)تجزیه و تحلیل گردید.
یافته ها:
فعاليت آنزيمهاي آسپارتات آمينوترانسفر� �ز (AST)،
آلانين آمينوترانسفر� �ز (ALP) و آلكالين فسفاتاز (ALP)
در موشهايي كه CCl4 را به تنهايي دريافت كرده اند (گروه شاهد) در مقايسه با گروه كنترلافزايش معني داري را نشان مي داد (به ترتیب 85/117، 6/468 و 97/134 درصد). ولی در موشهاي هپاتوتوكسيك كه عصاره گياه بيلهر به میزان 400 میلی گرم در هر کیلوگرم دريافت كرده اند كاهش معني داري به میزان 54/57، 5/64 و 42/34 درصد در فعاليت آنزيم هاي ذكر شده مشاهده گردید (جدول شماره 1).
غلظت پروتئين تام و آلبومين در موشهايي كه CCl4 را به تنهايي دريافت كرده اند (گروه شاهد) در
مقايسه با گروه كنترل كاهش معني داري به میزان 8/16 و 3/20 درصد را نشان مي دهد (05/0p<). استفاده همزمان از CCl4 و عصاره گياه بيلهر باعث افزايش و برگشت غلظت اين فاكتورها به حالت نرمال شده است (05/0p<). بر عكس غلظت بيلي روبين تام در گروه شاهد در مقايسه با گروه کنترل بیش از 800 درصد افزايش و مصرف عصاره گياه بيلهر به میزان 400 میلی گرم در هـــر کیلو گرم در موش هاي هپـــاتوكسيك سبــب
جدول شماره 1: تأثير عصاره گياه بيلهر بر میزان آنزيمهاي كبدي در موشهاي صحرايي هپاتوكسيك ناشي از تجويز تتراكلريدكرب� �
گروه
ALT (IU/L)
AST (IU/L)
ALP (IU/L)
کنترل (گروه 1)
9/19±5/54
3/15±25/151
73±5/304
شاهد (گروه 2)
*8/90±9/309
*4/83±5/329
*66/113±5/715
گروه 3
**5/42±25/166
**02/37±75/162
**37/108±5/586
گروه 4
**35/31±110
**83/25±9/139
**65/62±25/469
IU/L: واحد بین المللی در لیتر. ALT=آلانین آمینوترانسفر� � AST =آسپارتات آمینوترانسفر� �ز ALP= آلکالین فسفاتاز
-گروه کنترل: دریافت کننده روغن زیتون با دوز یک میلی لیتر به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن موش.- گروه شاهد: دریافت کننده یک میلی لیتر محلول تتراکلرید کربن و روغن زیتون. - گروه 3: دریافت کننده 200 میلی گرم پودر گیاه بیلهر به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن موش علاوه بر محلول تتراکلرید کربن و روغن زیتون- گروه 4: دریافت کننده 400 میلی گرم پودر گیاه بیلهر به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن موش علاوه بر محلول تتراکلریدکرب� � و روغن زیتون. - کلیه داده ها بر اساس میانگین±انحرف معیار می باشد.
*001/0>p نسبت به گروه کنترل، **001/0>p نسبت به گروه شاهد، 05/0>p بین گروه 3 و 4 در هر سه متغیر.
جدول شماره 2:تأثير عصاره گياه بيلهر بر غلظت سرمی پروتئين تام، آلبومين، بيلي روبين و درصد وزن كبد در موشهاي
صحرايي هپاتوكسيك ناشي از تجويز تتراكلريدكري� �
گروه
پروتئین تام (g/dl)
آلبومین (g/dl)
بیلی روبین (g/dl)
وزن بدن/وزن کبد (درصد)
کنترل (گروه 1)
88/0±25/6
36/0±35/3
04/0±25/0
27/0±97/3
شاهد (گروه 2)
*65/0±2/5
*4/0±67/2
†62/0±45/2
*5/0±68/4
گروه 3
**67/.±75/5
44/0±92/2
***38/0±45/1
**62/0±87/3
گروه 4
**19/1±35/6
**42/0±4/3
***23/0±95/0
**93/0±7/3
-گروه کنترل: دریافت کننده روغن زیتون با دوز یک میلی لیتر به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن موش.- گروه شاهد: دریافت کننده یک میلی لیتر محلول تتراکلرید کربن و روغن زیتون. - گروه 3: دریافت کننده 200 میلی گرم پودر گیاه بیلهر به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن موش علاوه بر محلول تتراکلرید کربن و روغن زیتون- گروه 4: دریافت کننده 400 میلی گرم پودر گیاه بیلهر به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن موش علاوه بر محلول تتراکلریدکرب� � و روغن زیتون. - کلیه داده ها بر اساس میانگین±انحرف معیار می باشد.
* 05/0>p نسبت به گروه کنترول، **05/0p<نسبت به گروه شاهد،*** 001/0 p<نسبت به گروه شاهد، †001/0p< نسبت به گروه کنترل، 05/0p< بین گروه 3 و 4 در کلیه متغیرها.
كاهش 22/71 درصدی غلظت بيلي روبين شده است (001/0p<) (جدول شماره 2). با توجه به مرگ و مير 80 درصدي موشهاي گروه آزمون سه سنجش فاكتورهاي بيوشيميايي اين گروه انجام نشد.
مصرف غذا، آب و افزايش وزن در موشهاي گروه شاهد در مقايسه با گروه کنترل كمتر و در گروههايي كه بطور همزمان CCl4 و عصاره بيلهر را دريافت كردند مشابه گروه کنترل بود اما از نظر آماري اين اختلافات معني دار نبودند.
نسبت وزن كبد به وزن بدن در گروه شاهد كه صرفاً CCl4 را دريافت كرده اند نسبت به بقيه گروهها افزايش معني داري را داشته است (05/0p<) (جدول شماره 2). بررسي هاي هيستوپاتولوژ� �ك تغييرات بارزي شامل كبد چرب (استئاتوزيس)، نكروز كبدي و فيبروز را در تمام گروههايي كه CCl4 دريافت كرده بودند را نشان مي دهد و مصرف عصاره گياه بيلهر اين تغييرات
را به ميزان زيادي كاهش داده است.
بحث:
تغييرات ناشي از تتراكلريدكرب� � شبيه بيماريهاي كبدي مزمن ناشي از ويروس ها مي باشد. تتراكلريدكرب� �
توسط سيستم سيتوكروم P450 به راديكالهاي آزاد
تري كلرومتيل تبديل مي شود. راديكالهاي آزاد توليد شده بطور كووالاني با غشاء هاي سلولي و اندامكها متصل مي شود و باعث پراكسيداسيون اسيدهاي چرب غير اشباع و اختلال در هموستاز كلسيم ودر نهایت مرگ سلولي مي گردد (12،11،10). راديكالهاي آزاد حاصل از CCl4 با تخريب غشاء هپاتوسيت افزايش
فعاليت آنزيم هاي نامبرده را سبب شده است و همين عامل باعث شده آنزيمهايي كه در حالت طبیعی درون سيتوزول سلولي قرار دارند وارد جريان خون شوند و افزايش فعاليت اين آنزيمها بيانگر ميزان و نوع آسيب هاي كبدي
است (13). در موشهايي كه علاوه بر تتراكلريدكرب� � عصاره گياه بيلهر نيز دريافت كرده اند فعاليت اين آنزيم ها به
صورت وابسته به دوز عصاره در مقايسه با گروه شاهد كاهش معني داري را نشان داد. برگشت فعاليت آنزيمهاي
فوق به حالت نرمال توسط عصاره گياه بيلهر دليل واضحي بر خاصيت محافظت كبدي عصاره اين گياه است.
كاهش پروتئين تام و آلبومين از جمله علائم پيشرفت بيماريهاي مزمن كبدي است و ميزان اين كاهش شدت آسيب كبدي را نشان مي دهد. همچنين تتراكلريدكرب� � با ايجاد آسيب در سلول كبدي باعث افزايش غلظت بيلي روبين مي گردد (15،14). در موشهايي كه CCl4 را به تنهايي دريافت كرده اند در مقايسه با گروه كنترل بطور معني داري كاهش غلظت پروتئين تام و آلبومين و افزايش غلظت بيلي روبين مشاهده مي شود. استفاده از عصاره گياه بيلهر باعث مي شود غلظت پروتئين تام، آلبومين و بيلي روبين به حالت نرمال نزديك شود.
تتراكلريدكرب� � با ايجاد آسيب در سلولهاي كبدي باعث مي شود فاكتورهاي مورد مطالعه در موشهاي گروه شاهد در مقايسه با گروه كنترل تغييرات معني داري نشان دهد ولي عصاره گياه بيلهر ضمن كاهش تغييرات ناشي از تجويز تتراكلريدكرب� � وضعيت فاكتورهاي بيوشيميايي مذكور را به حالت نرمال نزديك مي كند.
بررسي هاي هيستوپاتولوژ� � نمونه هاي كبدي در موشهاي گروه شاهد وجود كبد چرب، از بين رفتن تماميت هسته سلولي و فيبروزيس را نشان مي دهد. عدم وجود و يا كاهش اين تغييرات در گروههايي كه علاوه بر تتراكلريدكرب� � عصاره گياه بيلهر را دريافت كرده اند بيانگر خاصيت محافظت كبدي اين گياه مي باشد كه ممكن است با تثبيت غشاءهای سلولی صورت گیرد.
همچنین عصاره این گیاه از افزایش وزن کبد نـاشی از تأثیر
تتراکلریدکرب� � به میزان قابل توجهی جلوگیری می کند.
نتايج اين تحقيق نشان مي دهد كه عصاره گياه بيلهر اثر محافظتي كبد در برابر آسیب های ناشی از مصرف تتراكلريدكرب� � داشته است كه احتمالاً در ارتباط با خاصيت آنتي اكسيداني تركيبات موجود در این گیاه می باشد (16). زیرا آنتی اکسیدان ها نقش بسیار مهمی در محافظت اندامهای داخلی بدن بویژه قلب و کبد دارند (17،3).
نكته جالب توجه مرگ موشها به ميزان 16درصد در گروههاي آزمون دو و 80 درصد در گروه آزمون سوم مي باشد كه بيانگر سميت اين گياه در غلظت 500 ميلي گرم در هر كيلوگرم وزن بدن است.
بنابراين مي توان بيان داشت عليرغم اثرات محافظت كبدي عصاره گياه بيلهر، در دوزهاي بالا مي تواند اثرات سمي نیز داشته باشد. لذا پيشنهاد مي شود فیتوشیمی این گیاه بررسی و ترکیبات واجد خواص دارویی آن شناسایی شود.
نتیجه گیری:
نتايج حاصل از اين مطالعه نشان مي دهند عصاره گياه بيلهر در برابر آسيب هاي كبدي ايجاد شده توسط تتراكلريدكرب� � داراي اثرات محافظتي است.
تشکر و قدردانی:
بدینوسیله از مسئول محترم امور پژوهشي دانشكده پزشكي ياسوج بخاطر مهيا نمودن امكانات تحقيق فوق و همچنين سركار خانم شهربانو عسكريان و آقايان رضا محمدي و مهرزاد جعفري كارشناسان آزمايشگاههاي دانشكده پزشكي تشكر و قدرداني مي شود.
منابع:
1.Polini G, Parola M. Oxidative damage and fibrogenesis. Biol Med. 1997; 22: 287-305.
2.Sies H. Strategies of antioxidant defence. Eur J Biochem. 1993; 215: 213-19.
3.Ulican O, Greksak M, Vancova O, Zlatos L, Galbavy *, Bozek P, et al. Hepatoprotective effect of Roobos tea (Aspalathus linearis) on CCl4 –induced liver damage in rats. Physiol Res. 2003; 52: 461-66.
4.Sree RM, Srinivasan M. Hepatoprotective effect of Tephrosia purpurea in experimental animals. Indian J Pharmacol. 1993; 25: 34-6.
5.Germano MP, Angelo VD, Sanogo R, Catania *, Alma R, Pasquale RD, et al. Hepatoprotective and antibacterial effect of extracts from Trichilia emetica Vahi (Meliaceae). J Ethnopharmacol. 2005; 96: 227-32.
6.Ozbek H, Ugras *, Bayram I, Uygan I, Erdogan E, Ozturk A, et al. Hepatoprotective effect of Foeniculum vulgar essential oil: a carbon-tetrachloride induced liver fibrosis mode line rats. Scan J Lab Anim Sci. 2004; 31: 9-17.
7. زرگري علي.گياهان دارويي. چاپ چهارم. تهران: انتشارات دانشگاه تهران. 1365، جلد دوم. 21-212.
8.Wollenweber E, Dorr M, Rustayan A. Dorema auchri, the first umbelliferous plant found to produce exudates flavonoids. Phytochem. 1995; 38: 1417-27.
9.Hsiao G, Shen MY, Lin KH, Lan MH, Wu LY, Chou DS, et al. Antioxidant and hepatoprotective effect of antrodia camphorata extract. J Agric Food Chem. 2003; 51: 3302-8.
10. Venukumar MR, Latha MS. Hepatoprotective of the methanolic extract of Curculigo orchioides in CCl4-treated male rats. Indian J Pharmacol. 2002; 34: 269-75.
11. Ferre N, Camps K, Cabre M, Paul A, Joven J. Hepatic paraoxygenase activity alterations and free radical production in rats with experimental cirrhosis. Metabolism. 2001; 50: 997-1000.
12. Ozbek H, Ozturk M, Bayarm I, Ugras *, Citoglu GS. Hypoglycemic and hepatoprotective effects of Foeniculum vulgar Miller seed fixed oil extract in mice and rats. Eastern J Medicine 2003; 8: 35-40.
13. Yang H, Lee MK, Kim YC. Protective activities of stilbene glycosides from Acer mono leaves against H2O2-induced oxidative damage in primary cultured rat hepatocytes. J Agric Food Chem. 2005; 53: 4182-6.
14. Jayasekhar P, Mohanan PV, Rathinam K. Hepatoprotective activity of ethyl acetate extract of Acacia catechu. Indian J Pharmacol. 1997; 29: 426-8.
15. Sethuraman MG, Lalitha KG, Rajkapoor B. Hepatoprotective activity of Sarcostemma brevistigma against carbon tetrachloride-induced hepatic damage in rats. Curr Sci. 2003; 84: 1186-7.
16. Mirzaee A, Hakimi MH, Sadeghi H. Total antioxidant activity and phenolic content of Dorema auchri. Iranian J Biochem Mol Biol. 2005; 1: 116.
17. Aniya Y, Koyama T, Miyagi C, Miyahira M, Inomata C, Kinoshita *, et al. Free radical scavenging and hepatoprotective actions of medicinal herbs, Crassocephalum crepidioides from the Okinawa Islands. Biol Pharm Bull. 2005; 28: 19-23.
